Ящерицы

Использование гормональных антагонистов для подавления репродукции у ящериц, пятнистых эублефаров.

Краткий обзор
    С возрастающей популярностью рептилий как домашних питомцев, возрастает потребность в подавлении репродукции и связанных с ней, часто нежелательных, последствий. С целью развить терапевтическое лечение для стимулирования временного подавления репродукции, мы вводили капсулы тамоксифена пролонгированного действия, как подавляющего связывание эстрогена, или индометацин, ингибитор синтеза простагландина, внутрицеломически пятнистым эублефарам, Eublepharismacularius. 
     Все самки, получавшие лечение как тамоксифеном, так и индометацином (6 самок в каждой группе), в начале репродуктивного периода не показали какого-либо желточного отложения на протяжении 60-дневного срока действия капсул, в то время как 15 самок, получавших индометацин, были полностью ингибрированы на весь репродуктивный период, но у 50% самок развился генерализованный отёк. 50% самок, получивших тамоксифен, показали некоторый фолликулярный вителлогенез после окончания действия капсул, но ни одна из самок не отложила жизнеспособной кладки.
     Лечение тамоксифеном во время активного вителлогенеза было неэффективным в подавлении дальнейшего фолликулярного роста и овуляции. Девять из восьми самок, получивших тамоксифен, успешно размножались в течение года после лечения, и их репродуктивный выход (т.е. общее количество кладок, количество оплодотворенных кладок) был сопоставим с репродуктивным выходом контрольных самок. Эти результаты показывают, что тамоксифен может быть жизнеспособным средством для стимулирования временного ингибирования у рептилий, а также оправданно дальнейшее изучение.
ключевые слова: пятнистый эублефар, Eublepharismacularius, тамоксифен, индометацин, репродукция, подавление.

Введение
    Успешная репродукция рептилий в неволе, с упором на увеличение частоты и выхода, часто является основной целью многих разводчиков рептилий. Однако, рептилии становятся более привычными в качестве домашних питомцев, и в подобных ситуациях репродукция может быть нежелательной, а осложнения, связанные с репродуктивной активностью могут представлять угрозу для жизни (см. Ллойд 1990, ДеНардо 1996 о дистоциях у рептилий). Для большинства рептилий, раздельное содержание самцов и самок позволяет избежать репродукции. Однако, в некоторых обстоятельства индивидуальное содержание животных является невыполнимым, а также нежелательным. Кроме того, у некоторых видов, таких как часто содержащаяся зеленая игуана, Iguana iguana, самки становятся активными репродуктивно даже при отсутствии самца (Уиттиер и Крус, 1986, ДеНардо, 1996)    

      Хотя репродуктивная активность (например, вителлогенез, овуляция и откладка яиц) представляет естественный процесс, она ассоциируется с физиологическими и поведенческими изменениями, с которыми владельцы предпочли бы не сталкиваться. Такие изменения включают длительное отсутствие аппетита, потерю веса, мышечную атрофию и повышенную активность (Ллойд, 1990, ДеНардо, 1996, Стол, 1997). К тому же, вследствие того, что условия содержания в неволе обычно не идентичны сложность окружающей среды естественного места кладки, беременные самки могут испытывать дистоцию из-за этой нежелательной и непродуктивной активности. В то время, как зеленая игуана является самой популярной ящерицей, которая испытывает "спонтанные" репродуктивные циклы,  такая цикличность также представлена у других таксонов рептилий (например, хамелеонов, черепах), и также может приводить особей этих видов, содержащихся в неволе, к клиническому заболевания и даже смерти. (ДеНардо, 1996)

       На сегодняшний день для владельцев выбор ограничен необходимостью либо переживать этот ежегодный процесс и связанный с ним потенциальный риск здоровью, либо подвергать своих питомцев овариектомии, которая является дорогостоящий и необратимой процедурой. Однако современные знания об эндокринном контроле репродуктивных циклов рептилий делают теоретически возможным подавление гормонов, важных для вителлогенеза и овуляции и, следовательно, для репродуктивной активности, недорого и временно, таким образом сохраняя потенциал для размножения в будущем. 

     Репродуктивную систему самки регулирует ряд гормонов. Эстрадиол является главным стимулом синтеза в печени рептилии желтка (Ярон и Видзер, 1978, Хоу и др., 1982), тогда как простагландин очевидно играет жизненно важную роль в развитии фолликул и овуляции. У руинных [итальянских] ящериц, Podarcissicula, простагландин Е (PGE) важен для начала и поддержания вителогенного развития незрелой яйцеклетки (через опосредование эстрадиола), а простагландин F_2a (PGF_2a) стимулирует овуляцию (через опосредование прогестерона) (Джобетти и др., 1993). Несмотря на то, что не только гормоны вовлечены в процесс репродукции, как эстрогены, так и простгандиины играют немаловажные роли в регуляции репродуктивной активности самки, и, как следствие, химическое подавление любого из этих гормонов будет оказывать существенное воздействие на репродукцию.  

      Тамоксифен является широко используемым ингибитором связывания эстрогена и показан к применению для подавления эстроген-индуцированного вителлогенеза  у птиц (Gschwendt и др., 1986), рыб (Ле Менн и др., 1980). Они широко используется в исследованиях для определения эстрогенной эффективности химических реактивов (Пелиссеро и др., 1993). Индометацин был показан для подавления овариального синтеза простагландина у млекопитающих (Испай и др., 1982), птиц (Шимада и др., 1986), рыб (Гетц, 1983) и рептилий (Джиллетте и др., 1990). У ящериц индометацин задерживает как роды (Джиллетте и др., 1991), так фолликулярную стимуляцию гормонально индуцированной овуляции (Джоунс и др., 1990), но его воздействие на рост фолликул не изучено. Вследствие их эффективного подавления ключевых репродуктивных гормонов, мы предположили, что медленно высвобождающиеся имплантаты тамоксифена и индометацина эффективно и обратимо затормозят репродуктивную активность у ящериц. Если это подтвердится, то такое химическое лечение могло бы явиться клинически ценной альтернативой доступным на сегодняшний день ограниченным способам обеспечения репродуктивной пассивности (напр. оварио-сальпингэктомии).

Методы
Экспериментальные животные и их общее содержание
    В данном исследовании были использованы рожденные в неволе колонии (12 самцов и 30 самок) пятнистых эублефаров. Пятнистые эублефары – это крупные (220 мм) наземные гекконы (семейство Eublepharidae) родом из Азии (Хенкель и Шмидт, 1995). Они просты в содержании и хорошо размножаются в неволе, самки откладывают многочисленные кладки через несколько месяцев после появления предыдущего потомства.

     Животные содержались в индивидуально в Аризонском государственном университете, в полупрозрачных пластиковых выдвижных контейнерах размером 50 см х 20 см (Фридом Бридер, Данвилл, Калифорния). Во время их роста в течение года в помещении поддерживалась температура 25±1 ⁰С, а дополнительный обогрев обеспечивался с использованием греющей пленки Mylar (FlexWatt, WestWareham, MA), таким образом обеспечивая ящерицам градиент температур от 22 до 36 ⁰С. Освещение в помещении было установлено с учетом фотопериода 12:12 часов. В качестве субстрата использовались бумажные полотенца, а пищевая емкость с влажным вермикулитом выполняла роль укрытия и гнезда. Ящерицы потребляли от пяти до десяти сверчков, посыпанных карбонатом кальция, 2-3 раза в неделю. Количество и частота кормления зависели от времени года. Контейнеры увлажнялись дважды в неделю.

     В январе температура в помещении была снижена до 15 ⁰С, а дополнительные источники тепла и освещения были выключены примерно на месяц. Этот холодный период привел к стимуляции репродуктивной активности после возвращения к более высоким температурам.

Экспериментальная часть. Этап 1: подавление начала репродуктивной активности.
    Целью первого этапа эксперимента было установление эффективности тамоксифена и индометацина в предупреждении начала репродуктивной активности. Через 10 дней после окончания холодного периода 6 самок гекконов были случайным образом разделены на две опытные группы, тогда как остальные 18 самок представляли собой контрольную группу. Первая опытная группа (группа тамоксифена) получила капсулы 60-дневного пролонгированного действия (InnovativeResearchofAmerica, Сарагота, Флорида), содержащие 5 мг тамоксифена, в то время как вторая группа (группа индометацина) получила подобные капсулы, содержащие 5 мг индометацина. Капсулы были имплантированы внутрицеломически через боковой разрез, размером около 3 мм. Анестезия – изофлуран. На разрез был наложен шов. Контрольные животные подверглись подобному хирургическому вмешательству, но не получили капсул. Через 4 дня после имплантации мы начали вводить самцов в контейнеры самок. Каждый из 12 самцов случайным образом перемещался внутри колонии, проводя с самкой от 24 до 28 часов, прежде, чем переместиться к другой самке. Самке был предоставлен по крайней мере один самец в неделю на протяжении репродуктивного сезона.

Спаривание эублефаров

     Самки ежедневно взвешивались и визуально осматривались с целью выявления репродуктивной активности. Как фолликулы, так и яйца видимы и различимы через полупрозрачную брюшную кожу. При наличии фолликул, их диаметр измерялся микрометром. Беременные самки ежедневно проверялись на наличие яиц. Регистрировались развитие яиц, дата кладки, масса самки, номер яйца, масса яйца и качество яйца. Между группами данные сравнивались с использованием непарного t-теста (StatView, SASInstitute, Кэри, Нью Йорк).

Экспериментальная часть. Этап 2: Подавление активного вителлогенеза.
     Целью второго этапа исследования было установление эффективности терапевтических агентов в прерывании активного вителлогенеза. На 120 день после введения препаратов (два установленные периода действия капсул) самки из контрольной группы, у которых были фолликулы, были поочерёдно также подвергнуты имплантации капсул, подобных тем, которые были использованы в 1 этапе, или второй контрольной операции. После имплантации самки наблюдались, и данные собирались, как было описано в Этапе 1.

Экспериментальная часть. Этап 3: Обратимость репродуктивного подавления.
     Целью третьего этапа эксперимента являлось установить, было ли репродуктивное подавление, вызванное имплантированными капсулами, обратимо (например, были ли самки, которые репродуктивно подавлялись в течение года, способны к успешному размножению в следующем году). Через года самки подобным образом охлаждались в течение января, чтобы снова стимулировать репродуктивную активность. По окончании этого периода, они не подвергались ни какому воздействию, а просто содержались так же, как и в прошлом году. Сведения собирались и анализировались аналогично предыдущим этапам эксперимента.

Результаты
    Как тамоксифен, так и индометацин успешно подавляют фолликулярное отложение  желтка (вероятность < 0,001 для каждой терапевтической группы). Ни одна из шести самок, получивших тамоксифен, и ни одна из 6 самок, получивших индометацин, не показали выраженной вителлогенической активности в течение первых 60 дней после имплантации (в течение установленного срока действия имплантированных капсул). У 14 из 18 контрольных самок началась вителлогеническая активность в течение периода времени со средним началом, приходящимся на 22 день после хирургического вмешательства (от 3 до 60 дней). По окончании 60-дневного периода, три из 6 самок, получивших тамоксифен, показали начало вителлогенической активности (в пределах от 81 до 165 дней после имплантации), но не отложили кладок. Ни одна из 6 самок, получивших индометацин, не проявила какой-либо вителлогенической активности на протяжении всего репродуктивного периода. Одна из четырех контрольных самок, которая не проявляла вителлогенической активности первые 60 дней, начала вителлогеническую активность на 102 день. В то время, как тамоксифен не вызвал каких-либо клинических или поведенческих аномалий, у трёх из 6 самок, получивших индометацин, развился хронический генерализованный отёк, от умеренного до тяжелого, который через некоторое время самостоятельно прекратился. Из-за этого осложнения Этап 2 и Этап 3 эксперимента проводились только с применением тамоксифена.

      В начале 120-дневного периода после имплантации только у 7 контрольных самок были отмечены увеличенные фолликулы. Четверо из этих самок получили капсулу тамоксифена, а три из них подверглись фиктивной операции. Тамоксифен был неэффективен в задержке фолликулярного развития у трех из четырех самок, получивших капсулы, а две из трех контрольных самок овулировали и отложили яйца, которые развились из фолликул, присутствовавших на момент операции (вероятность = 0,846).

Яйца эублефаров
       

     Одна из 10 самок, получивших тамоксифен, погибла во время периода пониженной температуры, в результате к 3-му этапу исследования осталось 9 самок, подвергнутых воздействию тамоксифена. Так как смерть самки произошла во время периода пониженной температуры, ее гибель не была обнаружена достаточно быстро, чтобы можно было провести результативное вскрытие. Однако, так как до момента гибели прошло более 6 месяцев после окончания действия имплантата, вряд ли эта смерть была вызвана его воздействием. Пять контрольных самок первого года были случайным образом отобраны для контрольной группы Этапа 3. Не было выявлено ни какого отличия между группами, и восемь из 9 самок, получивших тамоксифен, успешно отложили по крайней мере одну кладку (т.е. 3,3 общего количества кладок, 2,6 оплодотворенных кладок) во время второго сезона, в то время как все пять контрольных самок отложили не менее одной кладки (т.е. 3,0 от общего количества кладок, 2,2 оплодотворенных кладок. Вероятность = 0,790 и 0,708 общего количества кладок и оплодотворенных кладок соответственно).

 Вылупление эублефаров

Обсуждение
    В то время, как индометацин был полностью эффективен в подавлении фолликулярной выработки желтка на протяжении всего репродуктивного периода, генерализованный отек имел место у 50% самок. Это означает, что он не может расцениваться как клинический ингибитор репродукции. Так как простагландины обладают широким спектром биологической активности, а индометацин является генерализованным ингибитором синтеза простагландинов, возникновение побочных эффектов неудивительно. При использовании в качестве нестероидного противовоспалительного препарата у людей, индометацин имеет низкое количество (<1%) случаев отеков (Арки, 1999). Не приводя к летальному исходу и проходя самостоятельно, гнерализованный отек, наблюдавшийся у получивших индометацин Eublepharismacularius, был достаточно серьезный, чтобы отказаться от его клинического применения.

     Клиническая ценность тамоксифена остается под вопросом, но результаты, изложенные здесь, делают его перспективным терапевтическим средством для временного подавления репродукции. Тамоксифен полностью подавляет вителлогенез во время срока действия капсул, и успешно подавляет репродукцию на протяжении всего активного сезона.

     Кроме того, самки, один год подвергавшиеся эффективному воздействию тамоксифена, имели нормальные репродуктивные попытки на следующий год, когда они не подвергались ни какому воздействию. Все вместе, эти результаты предполагают, что тамоксифен мог бы клинически использоваться для обеспечения эффективного, но обратимого репродуктивного подавления.

     Неспособность тамоксифена сдерживать поздние стадии фолликулярного развития понятна. Как блокатор связывания эстрогена, тамоксифен был бы эффективен в подавлении тех репродуктивных процессов, которые вызываются циркуляцией эстрогена. К ним относятся рецептивность самки, синтез желтка в печени и отложение желтка в фолликулах. Пока неизвестно, играет ли эстроген какую-либо роль в созревании фолликул и овуляции, а наши результаты позволяют предположить, что нет.

     Основываясь на наших данных, тамоксифен мог бы быть эффективным ингибитором репродукции только при применении до начала или на ранних стадиях роста фолликул. У видов, которые предсказуемо отвечают на сезонные изменения (например, на понижение температуры окружающей среды), время использования тамоксифена может быть с легкостью установлено. Однако, тамоксифен может оказывать незначительный эффект на конкретную особь, или на виды, у которых начало репродуктивной активности непостоянно.

     В то время, как, подобно овариэктомии, имплантация тамоксифена требует анестезии и внедрения в целомическую полость, инвазивность процедуры значительно отличается. Овариэктомия требует хирургического уровня анестезии и обширных манипуляций на внутренних тканях. Тогда как процедура имплантации может проводиться с использованием местной анестезии, с 3-мм разрезом, осуществляется простым введением капсулы в целомическую полость, и с наложением единственного шва, чтобы закрыть рану. Общее хирургическое время, необходимое для введения капсулы, составляет около двух минут. Таким образом, использование имплантатов тамоксифена потенциально является менее инвазивным и занимает меньше времени по сравнению с овариэктомией. Хотя применение тамоксифена не является очевидным клиническим решением для всех случаев, когда целью является репродуктивное подавление, его использование может быть полезным во многих случаях, особенно в тех, когда необходимо только временное подавление. Дальнейшие исследования, включая испытания на клинически более значимых видах (например, зеленая игуана, черепахи), являются оправданными.
 

Автор: перевод статьи с английского - masten
Опубликовано: 23.01.2011, в разделе: Ящерицы