"Малюсенький" – первый мышонок, который родился из перепрограммированных стволовых клеток (фото Qi Zhou/Chinese Academy of Sciences). Огромного труда стоило двум научным группам из Китая "зачать", вырастить и размножить животное без помощи клонирования и даже без разрушения эмбрионов. В ход впервые пошли необычные стволовые клетки. Результат пока, прямо скажем, средний. И всё же это несомненный прорыв в биологии, генетике и медицине. Итак, теперь научный мир знает: при приложении должных усилий можно не только вытащить рыбку из пруда, но и вырастить полноценное животное из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS-cells).
Поясним, что это за зверь. iPS-клетки — разновидность "взрослых" стволовых клеток. Индуцированными их называют потому, что клетки эти заставили притворяться эмбриональными стволовыми (ЭСК), искусственно включив экспрессию определённых генов, а плюрипотентными — так как они могут преобразовываться в клетки любой ткани будущего организма. Об их создании мы подробно рассказывали в этом материале.
iPS-клетки можно считать искусственно созданной этической заменой обычным ЭСК, которые можно заполучить, лишь разрушив эмбрион. Они были созданы в 2006 году группой профессора Синя Яманака (Shinya Yamanaka) из университета Киото.
Это открытие показало, что (пусть пока только в теории) человека можно лечить его собственными клетками, выращивая из индуцированных плюрипотентных отдельные ткани и даже целые органы.
Лечение больной мыши с помощью её же клеток, перепрограммированных в iPS-клетки, можно было бы осуществить по следующей схеме (иллюстрация Tom DiCesare). С самого начала было ясно, что вроде бы есть у iPS-клеток возможность вырасти и в полноценное здоровое млекопитающее (так же как и у эмбриональных стволовых клеток). Однако никому ранее не удавалось это сделать.
Учёные многих стран долгое время тренировались на мышах. Две последние публикации в журналах Nature и Cell Stem Cell свидетельствуют о том, что им это наконец-то удалось.
Первое масштабное достижение было получено группой специалистов под руководством Ци Чжоу (Qi Zhou) из Института зоологии Китайской академии наук (Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences) и Фани Цзэн (Fanyi Zeng) из университета Цзяо Туна в Шанхае (Shanghai Jiao Tong University). Раньше они клонировали животных, теперь же решили заняться теми самыми индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками.
Внедрение нужных генов с помощью ретровируса превращает обычную клетку в плюрипотентную (иллюстрация с сайта biotechprimerblog.com). Они, так же как и Яманака, использовали вирусные векторы, чтобы "приклеить" к фибробластам – клеткам соединительной ткани мышей – четыре гена и перепрограммировать их таким образом в плюрипотентные. Фибробласты были получены от эмбрионов на поздней стадии развития.
Для того чтобы определить, что же они в результате получили, китайцы первым делом провели основные тесты, позволяющие сравнить iPS-клетки с эмбриональными аналогами (определялось наличие особых поверхностных маркеров).
Схема, иллюстрирующая проведённую работу (иллюстрация Janet Rossant/Nature). Следующим шагом было создание тетраплоидного эмбриона (для этого учёные "смешали" две клетки оплодотворённого эмбриона, находящегося на ранней стадии развития).
Эта "оболочка" является своего рода колыбелью для будущего организма, из неё развивается плацента и некоторые другие важные клетки. Однако для появления собственно тела необходимы клетки эмбриональные. Иначе тетраплоидный эмбрион всё равно что машина без водителя, приводит сравнение Nature.
Далее в эмбрион с четырьмя наборами хромосом были имплантированы iPS-клетки (как мы уже знаем, являющиеся искусственной заменой эмбриональным). Они запустили процесс развития. После всех этих манипуляций плод вживили суррогатной матери, а спустя 20 дней родился мышонок.
Уже по внешним данным было ясно, что новорождённое животное (чёрный цвет шерсти) носит гены мыши, от которой были получены индуцированные плюрипотентные клетки (тоже чёрный окрас), а не той, из клеток которой были получены тетраплоидные эмбрионы (белый окрас).
Профили экспрессии плюрипотентных маркеров некоторых генов, полученные при помощи микроанализа (иллюстрация Nature). Однако для полной уверенности были проведены ДНК-тесты, подтвердившие, что мышонок по имени Сяо-Сяо (Xiao Xiao), или "малюсенький", вырос именно из iPS-клеток (среди всех отпрысков максимальная схожесть с "родителем" составила около 95%).
Эксперт по клонированию Рудольф Джаниш (Rudolf Jaenisch) из MIT рассказывает, что он и его коллеги пытались проделать похожий эксперимент в 2007 году. Однако они смогли создать лишь эмбрионы на поздней стадии развития.
"У меня два объяснения, почему мы не добились успеха. Первое — iPS-клетки не являются плюрипотентными. Второе — мы просто-напросто плохо старались. И сейчас я всё больше склоняюсь ко второму варианту", — говорит Джаниш.
Китайцы оказались трудолюбивее. Они выполнили гигантский объём работ: прежде чем получить первого "перепрограммированного" мышонка, им пришлось проанализировать 250 эмбрионов.
Кариотипический анализ iPS-клеток показал, что примерно у 75% из них, как и положено, по 40 хромосом. Учёным приходилось пересчитывать около сотни составляющих для каждого образца индуцированных плюрипотентных клеток (фото Nature). К моменту выхода статьи у учёных было 27 новых животных. Зоологи перепробовали массу вариаций различных параметров, но "рецептом" с самым лучшим выходом оказался тот, что дал 22 живых мышонка из 624 внедрённых эмбрионов. Таким образом, доля успешных попыток составила 3,5% (а это сравнимо с выходом типичных линий ЭСК!).
Достижение имеет несомненную научную ценность, однако ещё есть к чему стремиться. Цзэн подчёркивает, что по-прежнему высок уровень смертности и физических недостатков среди животных. Многие новорожденные умерли в первые два дня, большое количество родились с отклонениями в развитии (эти детали в статье отсутствуют, но появятся в следующей публикации).
Иерархия стволовых клеток: сначала тотипотентная клетка становится плюрипотентной, потом мультипотентной и, наконец, дифференцируется в клетку определённой ткани. Учёные пытаются развернуть этот процесс в обратную сторону (иллюстрация с сайта biocell.com.au). Впрочем, не всё так уж и плохо. 12 из 27 выживших мышат спарились и дали вполне здоровое потомство. Сейчас у первой группы китайских учёных несколько сотен грызунов второго поколения и около сотни третьего. Ни у одной особи не были обнаружены какие-либо опухоли (хотя систематических проверок зоологи не проводили).
Теперь о второй группе учёных из Национального института биологических наук в Пекине (National Institute of Biological Sciences — NIBS). Они тоже преуспели в выращивании мышей из iPS-клеток. Руководил исследованием доктор Шаожун Гао (Shaorong Gao).
Исследователи использовали практически такую же технологию, что и предыдущая группа. Только объёмы у них были поменьше: они перенесли индуцированные плюрипотентные клетки в 187 тетраплоидных эмбрионов. Из них родились всего двое мышат, один из которых умер в детстве. Таким образом, эффективность процедуры составила 1,1%, но и это тоже успех.
"Шансы заполучить работающую линию клеток невелики, но мы очень старались", — комментирует Гао. Сейчас учёные пытаются подобрать оставшейся в живых мышке пару, чтобы получить потомство.
Яманака тоже продолжает свои исследования. Недавно он и его коллеги получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки без использования вирусов (фото с сайта blogbus.com). В дальнейшем оба коллектива рассчитывают понять, в чём же всё-таки принципиальная разница между iPS-клетками и эмбриональными стволовыми клетками мышей.
То, что разница есть, никто уже не сомневается. Недавно команда исследователей из университета Калифорнии в Лос-Анджелесе (UCLA) обнаружила, что iPS и ЭСК различаются экспрессией генов. "Только мы пока не можем сказать, что работает лучше – настоящие эмбриональные стволовые клетки или их перепрограммированные собратья", — рассказывает один из авторов работы Кэтрин Плат (Kathrin Plath).
Уже сейчас Чжоу и Цзэн могут сказать, что многое определяется временем. Так, колонии индуцированных плюрипотентных клеток, полученные в течение первых 14 дней, гораздо более производительны (по количеству родившихся из них мышат), нежели те, чей "возраст" уже перевалил за 20 или даже 36 дней.
Если учёным удастся разобраться, то, возможно, и низкий выход, и высокую смертность, и большое количество физических отклонений можно будет преодолеть. Кроме того, полученные данные можно будет "перенести" и на человека, что позволит понять различия в наших клетках.
Отметим, что несмотря ни на что полностью ретранслировать работу на человека не удастся. Хотя бы в силу того, что невозможно создать его тетраплоидный эмбрион. Это также означает, что и о клинических испытаниях индуцированных плюрипотентных клеток (в качестве замены многообещающим ЭСК) пока говорить рано.
Если даже попробовать осуществить такой же процесс с людьми (что опять же неэтично), то в результате всё равно получится не тот человек, клетки которого изначально взяли для перепрограммирования (фото с сайта msn.com). "Для нас все эти данные – лишь модель, показывающая возможности перепрограммирования клеток. Мы не рассматриваем нашу нынешнюю работу как первую ступеньку на пути создания из iPS-клеток человека", — говорит Чжоу.
Среди прочих планов генетиков: доказать, что существует возможность создать здоровое животное из клеток взрослой мыши (напомним, в данных работах использовались клетки, полученные от эмбрионов на последней стадии развития).
Типичная схема клонирования животного на примере овечки Долли. Донором ядра была взрослая клетка, взятая из молочной железы одной овцы (справа). Ядро при помощи электрического импульса смешали с яйцеклеткой с удалённым ядром от другой особи (слева). Ооцит пересадили суррогатной матери, из него развилась Долли, клон донора ядра (иллюстрация с сайта allthingsstemcell.com). А ещё Чжоу и Цзэн хотят сравнить "перепрограммированных" мышек с клонированными (выращенными классическими методами). Учёные полагают, такой обходной метод позволит получить полностью идентичных клонов с меньшим количеством отклонений.
membrana.ru
